ضرورت پلیت بلاد آگار استاندارد جهت تعیین همولیز با استرپتوکوکی

6 ژانویهٔ 2020 21:36:37

ضرورت پلیت بلاد آگار استاندارد جهت تعیین همولیز با استرپتوکوکی

روش رشد استرپتوکوکها در پلیت های بلاد آگار، که ابتدا توسط Schottmiiller پیشنهاد شده است، معنای ارزشمندی از تمایز را پیدا کرد. اسکات مولر دریافت که بوسیله ی رشد ترکیبی شامل: 2 میلی لیتر از خون دفیبرینه ی انسان و 5 میلی لیتر از آگار مسطح، استرپتوکوکی میتواند به 3 گروه متمایز تقسیم شود. او آنها را بدین ترتیب نامگذاری کرده است:

-        Streptococcus longus seu erysipelatos

که پس از 18 الی 24 ساعت انکوباسیون ظاهرمی شود. فرم آن بصورت یک کلنی دایره ای شکل خاکستری رنگ است که توسط توده ای از همولیز با قطر 2 الی 3 میلیمتر احاطه شده است.

-        Streptococcus mitior seu viridans

که پس از 24 ساعت انکوباسیون بصورت یک کلنی سبز رنگ بسیار ریز ظاهر می شود. در هیچ جا همولیز ظاهر نمی شود مگر آنجایی که ضخامت محیط بسیار کم است.

-        Streptococcus mucosus

که پس از 24 ساعت انکوباسیون بصورت یک ناحیه ی مخاط مانند سبز رنگ بسیار مرطوب رشد می کند.

توجه داشته باشید که میتوانید انواع محیط کشت میکروبی را در این صفحه مشاهده نمایید.

این نتایج توسط تعداد زیادی از محققان و همچنین افرادی همچون Schumacher، Silverstorm، mandelbaum و بسیاری از افرادی که این روش را به عنوان معنای ارزشمندی از تمایز پذیرفتند بدست آمد.

از طرف دیگر محققانی به نام های Bietske و Rosenthal اثبات کردند که صفات موروثی همولیزی، می توانند بصورت غیر همولیزی تبدیل شوند و بالعکس. Mandelbaum با استفاده از محیط متفاوت، نتایج متفاوتی گرفت. وی دریافت که بر روی پلیت های بلاد آگار که مطابق فرمول Schottmiiller ساخته شده است، نوعی همولیز توسط Streptococcus mitior تولید می شود که بصورت زیر شرح میدهد:

ناحیه همولیتیک در mitior به ندرت در 24 ساعت ظاهر می شود، بلکه بیشتر در 48 تا 96 ساعت انکوباسیون ظهور می کند.

با استفاده از میکروسکوپ، سلولهای خونی را مستقیماً زیر کلنی پیدا کردیم، در حالیکه بسیاری از سلول های رنگی در منطقه ی شفاف باقی مانده اند، بطوریکه در مناطق دورتر از کلنی بسیار فراوان تر دیده میشوند.

Smith و Brown بر روی تغییرات مشابه در همولیز تمرکز کردند و نام های نوع بتا را برای همولیز مجزا و نوع آلفا را برای همولیز غیرمجزا برگزیدند.

بنظر می آید که توجه کمی به به کارهای mandelbaum شده است. نتیایج درج شده در تخمین همولیز روی بلاد آگار رای کننده نیستند و همچنین مقایسه ی نتایج سخت است. خون دفیبرینه و سیتراته ی انسان، اسب، خرگوش، گوسفند و بز در مقادیر متنوع جهت آماده سازی پلیت های بلاد آگار استفاده میشوند و نتایج پس از 24 الی 96 ساعت انکوباسیون خوانده می شوند.

Von Lingelshcim بر اهمیت و ضرورت وجود یک تکنیک استاندارد در تخمین همولیز تمرکز کرد و در همین اواخر شخصی به نام Holman محیطی را پیشنهاد داد که متشکل از 5 میلی لیتر از خون دفیبرینه ی انسان در 100 میلی لیتر آگار مسطح است. این محقق همچنین توجه ویژه ای به تغییرات همولیز ناشی از سایر پارامتر ها داشت. مواردی همچون مدت زمان انکوباسیون، میزان غلظت نمک بر روی agar base، دمای آگاری که خون به آن افزوده می شود و سن پلیت های بلاد آگار. در کار ارائه شده در اینجا ، 5 گونه استرپتوکوک پلیت های بلاد آگار با ترکیبات متفاوت مورد بررسی قرار گرفت.

یکی از انواع بلاد آگار های پرکاربرد محیط کشت بلاد آگار ایبرسکو است که توصیه میکنیم حتماً آن را بررسی نمایید.

ارگانیسم 1 یک استرپتوکوک با زنجیره بلند همولیتیک قوی بود که از پوست یک مورد از erysipelas جدا شده بود. ارگانیسم 2 نوعی همولیتیک از گلو درد اسکارلاتین بود. ارگانیسم 3 یک استرپتوکوک همولیتیک با زنجیر بلند به دست آمده از لوزه ها در صورت تب روماتیسمی بود. ارگانیسم 4 یک استرپتوکوک کوتاه زنجیره ای غیرهمولیتیک بود که از خلط یک مورد ذات الریه به دست آمده بود. ارگانیسم 5 یک استرپتوکوک تولیدکننده رنگ سبز بود که از همان لوزه 3 به دست آمد.

ارگانیسم های 1 و 5 ساکاروز ، لاکتوز و مالتوز تخمیر کردند. ارگانیسم 2 لاکتوز ، مانیت ، رافینوز ، مالتوز و دکستروز تخمیر می کند. ارگانیسم 3 ساکاروز ، لاکتوز ، مالتوز و دکستروز تخمیر می کند. ارگانیسم 4 فقط مالتوز تخمیر میکند.

هر یک از این ارگانیسم ها به طور مکرر از یک کلنی تنها بر روی پلیت های بلاد آگار خون دفیبرینه ی انسان به دکستروز براث مایع منتقل شده و مجدداً به منظور اطمینان از strain خالص، روی پلیت روکش شدند.

تلقیح با ریختن قطره ای از محیط کشت دکستروز براث مایع در صفحات تازه تهیه شده و به مدت 4 الی 6 ساعت انجام شد. صفحات پس از انكوباسيون 24 ساعته در دماي 37 درجه سانتيگراد مورد مطالعه قرار گرفتند. همچنین بعد از 48 ساعت و بعد از 96 ساعت. شرایط اصلی تا حد امکان یکسان نگه داشته می شد. بنابراین، تمام آگار استفاده شده از یک سری ساخت بود. یک قسمت از آگار 1٪ قلیایی با هیدرات سدیم، یک قسمت دیگر 1٪ اسید با اسید هیدروکلریک ساخته شد و قسمت سوم از آگار استاندارد با 1٪ دکستروز ساخته شده بود.

خون سيتراته به وسيله آسپيره شدن از يك سیاهرگ به مقدار مساوي 2 درصد سديم سديم در محلول نمك فيزيولوژيك جمع آوري شد.

مشاهدات مربوط به همولیز ممکن است به گروه های زیر تقسیم بندی شود:

1-     نوع محیط

2-     نوع خون

3-     روش جمع آوری خون

4-     میزان خون در هر پلیت

5-     تعداد کلنی ها در هر پلیت

6-     مدت زمان انکوباسیون

 

تاثیر نوع محیط کشت بر نتایج همولیز

تغییرات مشخص شده در هر دو روش ماکروسکوپی و میکروسکوپی در ناحیه همولیتیک بر روی آگار ساده، آگار قلیایی،آگار اسید و دکستروز آگاری رخ داده است که به خونی که نسبتش قبلاً گفته شده اضافه شده بود. بنابراین، هیچ همولیزی در بلاد آگار قلیایی توسط هیچ یک از ارگانیسم ها تولید نشد. ارگانیسم 1 یک منطقه همولیتیک مشخص در بلاد آگار خون دفیبرینه ی انسان ایجاد می کند، اما یک منطقه نامعین در محیط اسیدی. با ارگانیسم 3، نتایج معکوس بود. ارگانیسم 2 منطقه مشخصی از همولیز را بر روی بلاد آگار خون دفبرینیه ی گوسفند و بلاد آگار سیتراته ی گوسفند و بر روی بلاد آگار خون دفبرینه ی اسیدی گوسفند ایجاد می کند، اما یک منطقه مشخص از همولیز روی بلاد آگار گوسفندی سیتراته ی اسیدی می دهد. تغییرات مشابه در مورد ارگانیسم های دیگر نیز رخ داده است. تغییرات در عرض ناحیه همولیتیک نیز رخ داده است. به نظر نمی رسد این بی نظمی ها وابسته به فراوانی رشد باشد. همانطور که توسط Liyal نشان داده شده است، همولیز به روشنی بر روی دکستروز بلاد آگار مهار شد!

ارگانیسم 5 (viridans) به طور تقریباً مساوی از رنگ آمیزی مایل به سبز بر روی آگارهای ساده، اسیدی و قلیایی و رنگ آمیزی قابل توجه تر روی دکستروز بلاد آگار داد. ارگانیسم 2 رنگ مایل به سبز را بر روی بلاد گار دفبرینه ی انسان با دکستروز ایجاد كرد ،در حالی كه هیچ تغییری با ارگانیسم های 1 ، 3 ، 4 و 5 ایجاد نشده بود. این، که تا حدودی با مشاهدات Ruediger متناقض است، بر تغییرات گسترده در این گروه تأکید دارد.

از جمله محیط های پرکاربرد که به احتمال زیاد به آن نیاز دارید یا نیاز پیدا خواهید کرد محیط کشت EMB است که دیدن آن را به شما توصیه میکنیم.

تاثیر نوع خون بر نتایج همولیز

از خون گونه های متنوعی استفاده شده است و فقط چند مطالعه مقایسه ای انجام شده است. محققی به نام SilverStorm ازخون دفیبرینه ی خرگوش، اسب و انسان استفاده کرد، اما او هیچ تفاوت قابل توجهی را ذکر نمی کند. تعدادی از ناظران به دلیل تشخیص سریع گلبول ها، خون خوکچه هندی را نامناسب میدانند. Kerner دریافت که گلبول های سگ به راحتی همولیز می شوند، در حالی که گلبول های انسان و قورباغه مقاوم ترین هستند. در این مطالعه ازخون گوسفند، بز، اسب، خرگوش و انسان نیز استفاده شد. تغییرات به ویژه در شکل میکروسکوپی منطقه همولیتیک نشان داده شده است.

ارگانیسم 1 در 24 ساعت انکوباسیون، بطور کامل بر روی گلبول های خون دفبرینیه ی گوسفند و اسب حل شد در حالی که گلبول های انسان، خرگوش و بز حل نشدند. ارگانیسم 2 گلبول ای سیتراته ی گوسفند را در اسید آگار حل کرد اما گلبول های خون دفیبرینه ی گوسفند نه در آگار حل شد و نه در اسید آگار. سلول های انسان در محیط اسیدی حل شدند در حالی که گلبولهای خرگوش در محیط آگار ساده  حل شدند و گلبول های اسب در هیچکدام از موارد حل نشدند. ارگانیسم 3 هم فقط گلبول های خرگوش را حل کرد. ارگانیسم 4 هم فقط بر روی خون اسب همولیز تولید کرد. تولید رنگ سبز توسط ارگانیسم 5 بیشتر از همه بر روی خون گوسفند گزارش شد و کمتر از همه بر روی خون انسان. متاموگلوبین با سرعت بیشتری روی خون خرگوش شکل گرفت.

تاثیر روش جمع آوری خون بر نتایج همولیز

خون دفیبرینه یا سیتراته توسط اکثر کارکنان آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرد. Schumaker از خون دفیبرینه ی بز و انسان استفاده کرد که با استفاده از هیروبین از لخته شدن آن جلوگیری به عمل آمده بود. او هیچ تغییر و تفاوتی مشاهده نکرد. Bernstein و Epstein از خون گاو نر استفاده کردند که بصورت زیر ایمن سازی شده بود:

400 میلی لیتر از خون گاو نر در یک فلاسکی جمع آوری شد که استریل بود و حاوی 30 میلی لیتر از آمونیوم اگزالات 1% محلول در آب مقطر و همچنین 0.5 میلی لیتر از فرمالین 40%. ابتدا آن را با مقادیر مساوی از محلول 0.9 درصد نمک رقیق میکنیم و سپس تا نیم ساعت صبر میکنیم. Schottelius استفاده از خون تازه ی انسان را پیشنهاد داد ولی هیچ دلیلی برای پیشنهادش نداشت. خون دفیبرینه و سیتراته ی خرگوش، گوسفند و انسان در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت. هیچ تفاوتی مشاهده نشد. در زیر میکروسکوپ، سلول ها در بلاد آگار سیتراته سریعتراز خون دفیبرینه حل می شدند. با این وجود هیچ نظمی در این رابطه قابل تعیین نیست.

تاثیر میزان خون در هر پلیت

شاید بیشترین تغییرات در صورت استفاده از مقادیر متفاوتی از خون، مشاهده شود. ارگانیسم 1 در حالتی که شامل 3 و قطره از خون دفیبرینه ی اینسان است یک منطقه ی وسیعتری بر روی محیط ایجاد کرد نسبت به حالتی که شامل 9 و 12 قطره است. در پلیت های ایجاد شده با 3 و 6 قطره، همولیز واضح و مجزا است در حالیکه در پلیت ها ساخته شده با 9 و 12 قطره، همولیز مبهم و غیر واضح است. ارگانیسم 2 یک منطقه ی واضح از همولیز را با عرض 10 الی 14 میلی متر بر روی محیطی که حاوی 3 و 6 قطر از خون دفیبرینه بود ایجاد کرد در حالی که عرض این ناحیه در حالت 9 و 12 قطره ای حدود 4 الی 8 میلی متر است. البته در حالت 12 قطره ای ان ناحیه پس از 24 ساعت ایجاد می شود. ارگانیسم 3 در حالات 3،6 و قطره ای یک ناحیه ی همولیز واضح به عرض 1 الی 3 میلی متر ایجاد کرد در حالیکه در حالت 12 قطره ای یک ناحیه ی مبهم غیر واضح به عرض 3 تا نهایتاً 6 میلی متر ایجاد می شود.

تاثیر تعداد کلنی ها

در موارد متعددی این نتیجه گرفته شده که اگر کلنی ها ایزوله و جدا جدا باشند، ناحیه ی همولیز واضحی شکل می گیرد. اما اگر کلنی ها بصورت درهم و بسیار نزدیک به هم باشند نواحی همولیز مبهم و غیر واضح خواهند شد. در آزمایش viridans تولید رنگ سبز هنگامی که کلنی ها ایزوله و جدا بودند بصورت یک حلقه ی نازک ولی واضح با رنگ مایل به سبز اتفاق افتاد. در حالی که وقتی کلنی ها به هم نزدیک بودند یک پراکندگی رنگ اتفاق افتاد.

ممکن است به دلیل کار با محیط ها، سوالاتی در مورد اتوکلاو هم داشته باشید. در مورد نحوه ی کار با آن و یا موارد و نکات ایمنی توصیه میکنیم حتماً مقاله ی اتوکلاو را مطالعه نمایید.

تاثیر زمان انکوباسیون

پلیت ها پس از 24، 48 و 96 ساعت انکوباسیون در دمای 37.5 درجه خوانده می شدند. در برخی موارد سلول ها پس از 24 ساعت حل می شدند در حالیکه در 24 ساعت نمایان بودند. در مورد ارگانیسم 2 منطقه ی واضح و شفاف همولیزی در 24 ساعت انکوباسیون، پس از 48 ساعت انکوباسیون کاملاً تیره و تار و مبهم شد این ماجرا برای خون خرگوش و اسب بطور کامل بود ولی در مور خون گوسفند و انسان تیرگی و ابهام کمتری وجود داشت و دلیل آن هم تولید متاموگلوبین بود.

رنگ پراکنی Viridans معمولاً در 48 ساعت انکوباسیون واضح بود و همچنین در مورد خون خرگوش رنگ مایل به قهوه ای به جای سبز در مدت زمان 96 ساعت انکوباسیون تولید شد. ارگانیسم 4 بر روی خون اسب در مدت زمان 96 ساعت انکوباسیون، از کلنی ها و پلیت های ارگانیسم 5 (viridans) یک ناحیه ی سبز رنگ غیر قابل تشخیص ایجاد کرد.

در تعیین یک محیط استاندارد نکات مشخصی را باید در ذهن داشته باشید: 1- در دسترس بودن. 2- ثبات مواد. 3- المان های ضروری جهت رشد مناسب ارگانیسم.

در حالیکه این مقاله در حال تکمیل بود Holman محیط استاندارد جهت تعیین همولیز را معرفی کرد که شامل 5 میلی لیتر خون دفیبرینه ی انسان در 100 میلی لیتر آگار بود. آگاری  که مطابق با دستور العمل خودش ساخته می شود. از آنجایی که آگار استاندارد چندین سال در آنالیز آب هم استفاده شده است و در بیشتر آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار گرفته است، داشتن یک آگار پایه ی مشخص بسیار ضرورت و اهمیت یافته است. آگار پایه ای که توسط Holman پیشنهاد شد طرز تهیه ی بسیار آسان تری دارد و همچنین به احتمال خیلی زیاد شما را به هدفتان می رساند. خون انسان بسیار در دسترس است و در برابر همولیز با سوش های همولیتیک ضعیف مقاومت می کند. من معتقدم که محیط هولمن حاوی مقادیر خون بسیار کمی است، اما همولیز در بسیاری موارد مبهم و غیرواضح است. بسیاری از سویه های تازه جدا شده در محیط حاوی چنین مقدار کمی هموگلوبین بسیار ضعیف رشد می کنند.

Schottmuller در ابتدا از 2 میلی لیتر خون دفیبرینه انسان در 5 میل لیتر آگار استفاده کرد. به این دلیل است که من معتقدم که میزان خون بیش از حد نیاز و ضرورت است و نتایج به اندازه ی کافی خوب نیست که بتواند استفاده از آن را تضمین کند.

تکنیک زیر برای تهیه یک آگار خون استاندارد پیشنهاد شده است:

آگار استاندارد مورد استفاده در تجزیه و تحلیل آب در مقادیر 40 تا 100 سی سی در فلاسک ها قرار می گیرد.

اینها تا زمانی که آگار ذوب شود گرم می شوند و سپس تا 45-50 درجه سانتیگراد سرد می شوند.

برای هر 6 سی سی آگار پایه یک سانتی متر مکعب از خون دفیبرینه شده انسان اضافه می شود و تمام آن کاملاً میکس می شود.

تقریباً 7 سی سی برای هر پلیت استفاده می شود.

رگه های سطحی ساخته می شوند و نتایج پس از 24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد مشاهده شوند.

کلنی های ایزوله فقط باید توصیف شوند. در چنین پلیت هایی، سوش های استرپتوکوکی، پنموکوکی و گونوکوکی معمولاً به راحتی قابل رشد و پرورش هستند.

نتیجه گیری

تغییرات برجسته در هر دو شکل ماکروسکوپی و میکروسکوپی ناحیه همولیتیک استرپتوکوکی در پلیت های بلاد آگار رخ می دهد.

تمایز و مقایسه گونه های استرپتوکوکی بر روی بلادآگار ترکیب نامشخص یا متغیر کاملاً غیرقابل اعتماد و بی ارزش است.

برای این منظور باید از بلاد آگار استاندارد مانند آنچه در این مقاله توصیه می شود استفاده شود.

Post Comments

ارایه‌ی توضیح




* Required Fields